PCR扩不出来，紧急求助

今天宠物迷的小编给各位宠物饲养爱好者分享dmso作用pcr的宠物知识，其中也会对PCR扩不出来，紧急求助(PCR扩增失败原因)进行专业的解释，如果能碰巧解决你现在面临的宠物相关问题，别忘了关注本站哦，现在我们开始吧！

PCR扩不出来，紧急求助

我认为，“溴酚蓝带（约300bp）前后各有一条带，且两条带亮度差不多”，而“*性对照（没加模板）只在溴酚蓝带后有一条带”。可以用实验组和*性对照组比较，若两者溴酚蓝带后的带位置一直，那么应该是引物二聚体。 至于PCR，应从很多方面考虑，我有一个优化的方法： PCR必需具备下述基本条件：模板核酸（DNA或RNA）、人工合成的寡核苷酸引物、合适的缓冲体系、合适的Mg2+浓度、三磷酸脱氧核苷酸、耐热DNA聚合酶、温度循环参数、其它因素如二甲基**、**、石蜡油、明胶等。 1．引物 PCR扩增产物的大小是由特异引物限定的，因此引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义。 l引物合成的质量：合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整的序列和脱嘌吟产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。引物不用时应存于–20℃保存。引物的设计原则：见引物的设计 l引物的用量：一般PCR反应中引物的终浓度为0.1~1umol/L，引物浓度过低则产物量降低；引物浓度过高会促进非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成，它们与靶序列竞争DNA聚合酶和dNTP,从而使靶序列的扩增量降低。 2．缓冲液 目前最为常用的缓冲体系为10~50mmol/L。Tris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3,△pKa值为–0.021/℃。因此,20 mmol/L Tris–HCI(pH8.3,20℃)在实际PCR中,pH变化于6.8~7.8之间。改变反应液的缓冲能力,如将Tris浓度加大到50mmol/L, pH8.9,有时会增加产量。反应混合液中50mmol/L以内的KCl有利于引物的退火, 50mmol/L NaCl或50mmol/L以上的KCl则抑制Taq DNA聚合酶的活性。有些反应液中以NH4+代K+,其浓度为16.6mmol/L。反应中加入小牛血清白蛋白(100μg/ml)或明胶(0.01%)或Tween20(0.05%~0.1%)有助于酶的稳定,反应中加入5 mmol/L的二巯苏糖醇(DTT)也有类似作用,尤其在扩增长片段(此时延伸时间长)时,加入这些酶保护剂对PCR反应是有利的。 3.Mg2+ lMg2+是Taq DNA聚合酶活性所必需的，也影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，则酶催化非特异的扩增。 lPCR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的磷酸基因均可与Mg2+结合，降低Mg2+浓度，而Taq DNA聚合酶需要的是游离Mg2+。因此，PCR中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.2~2.5m mol/L。最好对每种模板,每种引物均进行Mg2+浓度的优化。另外还需注意引物和模板DNA原液中如含EDTA等螯合剂也会影响游离Mg2+浓度。 l优化Mg2+浓度法:首先须知模板DNA,引物和dNTP浓度和设定的PCR循环参数。反应中的PCR缓冲液中不加Mg2+。Mg2+是从10mmol/L MgCl贮存液中逐一加入反应管中。开始以0.5mmol/L递增(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5~5.0mmol/L)，在确定了Mg2+大概浓度以后，再在该浓度上下，以0.2 m mol/L递增和递减几个浓度来精确确定Mg2+的最适浓度。 4．三磷酸脱氧核苷酸 ?0?2?0?2 l贮备dNTP液应用NaOH调pH至中性，其浓度用分光光度计测定。贮备液为5~10 mmol/L，分装后–20℃保存。在PCR的重复热循环过程中其热稳定性应为：50循环后约有50%仍为dNTP。 l 反应中每种dNTP（dATP，dGTP，dTTP和dCTP）的终浓度为20―200umol/L,在此范围中，PCR产物量、特异性合成和忠实性间的平衡最佳。所用的四种dNTP终浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。最低的适宜dNTP浓度可根据特定靶序列长度和碱基组成来确定。保持四种dNTP的浓度均在10~15umol/L以上，对保持碱基掺入的忠实性是很重要的。dNTP终浓度大于50 mmol/L时会抑制Taq DNA聚合酶活性。 ldNTP的类似物也可掺入PCR产物。 5．耐热DNA聚合酶 l自从耐热Taq DNA聚合酶引入PCR后，又有多种耐热DNA聚合酶（VENT和Tth等）相继用于PCR。目前仍以Taq DNA聚合酶应用较多。不同来源聚合酶制备条件、测定方法和（或）单位定义有所不同，使用时需加以注意。 l酶的需要量可根据不同的模板分子或引物而变化。当优化PCR时，最好在每100μ1反应体积中加入0.5~5U酶的范围内试验最佳酶浓度。如果酶浓度太高，则琼脂糖凝胶电泳中会出现非特异扩增带；过低时，则靶序列产量很低。 lPCR后可通过下述方式之一灭活Taq DNA聚合酶：（1）99~100℃加热10min；(2)加入EDTA-Na至10mmol/L螯合Mg2+；（3）酚一氯仿抽提、乙醇沉淀PCR产物。 6．温度循环参数 ①变性温度与时间：PCR的变性一步很重要，此步若不能使靶基因模板和（或）PCR产物完全变性，变会导致PCR失败。典型的变性条件是95℃30s或97℃30s，更高的温度可能更有效，尤其是对富含G+C的靶基因。DNA在其链分离温度（strand separation temperature,Tss）时的变性只需几秒钟，然而反应管内部达到Tss还需一定时间。变性温度太高会影响酶活性。最简单的方法是在加Taq聚合酶前选使模板在先97℃变性lmin，对PCR的成功亦有益处。环状质粒DNA模板最好酶切线性化，因环状DNA复性极快。在扩增短片段（100~300bp）时，可用简便、快速的两步PCR法，同时在5~10个循环后，将变性温度降至87~90℃可改善PCR产量。具体降低程度则根据具体反应和使用的PCR仪而定。 ②复性温度与时间：如果说变性温度对PCR反应的成败是关键，那么复性温度则决定着PCR的特异性。引物复性所需的温度与时间取决于引物的碱基组成、长度和浓度。合适的复性温度应低于扩增引物在PCR条件下真实Tm值的5℃。根据下式计算最适复性温度（Tm）有助于PCR的成功。 另一种更简便的方法是通过引物的有效长度(Ln)来估算。在此，还需引入另一概念，即有效启动温度（effective priming temperature Tp）。Tp是最佳引物介导扩增发生时的最高温度。Tp在一定范围（20~35个核苷酸）内与Ln呈直线相关。Lp=22+1.45(Ln):其中Ln=2（G+C）+（A+T）最适复性温度为Tp±2~5℃。Tp值较引物模板的Tss值高5~10℃，这是因引物复性后，DNA聚合酶很快发生聚合反应，在引物3’端加上数个碱基使引物–模板更稳定，易于在较高温度下发生延伸。研究表明，引物的复性是受动力因素控制的，而不是受热力学参数控制的。它取决于引物解离与延伸效率间的平衡。Tp仅是PCR的最适复性温度，也是PCR最佳特异性温度，在等位基因特异PCR（AS–PCR）时决定Tp很重要。Tp值基本上不受Mg2+浓度影响，当Mg2+由1.5mmol/L升至10 mmol/L时，Tp才升高3℃。确定了复性温度后，复性时间并不是关键因素。但复性时间太长会增加非特异的复性。复性时间也不能太短（≥30s），如用手控温度反应，复性状态的时间不能太长，耽搁过长会增加非特异复性。 ③延伸温度与时间 引物延伸温度一般为72℃（较复性温度高10℃左右）。不合适的延伸温度不仅会影响扩增产物的特异性，也会影响其产量。72℃时，核苷酸的掺入率为每秒35~100个核苷酸,这取决于缓冲体系、pH、盐浓度和DNA模板的性质。72℃延伸1min对于长达2kb的扩增片段是足够的。然而，延伸时间决定于靶序列的长度与浓度。3~4 kb的靶序列需3~4 min延伸，延伸时间过长会导致非特异扩增带的出现。PCR中前几个循环延伸时间应足够长以使靶序列延伸完全，对很低浓度底物的扩增延伸时间要长些。 ④循环数 循环数决定着扩增程度。在其它参数都已优化条件下，最适循环数取决于靶序列的初始浓度。过多的循环会增加非特异扩增产物的数量和复杂性（见平台效应）。当然，循环数太少，PCR产量就会极低。在初始靶序列为3X105，1.5X104，1X103和50拷贝分子时，其循环数可分别为25~30，30~35，35~40和40~45个循环。 除循环数外，扩增效率也决定扩增程度的重要因素。实验表明，以染色体DNA为模板时，第25~30个循环过程中，扩增DNA明显增加。扩增程度（Y）、起始DNA量（A）、扩增效率（R）和循环数（n）间的关系为：Y=A（I+R）n效率为100%时，25个循环后，Y=225·A=33 554 432A，而效率R=90%，n=25时，Y=1.925=9 307 649A，扩增产物减少了72%，由此可见扩增效率对扩增程度的影响。 ⑤其它因素 高温起动（hot start）：由于Taq DNA聚合酶低温下仍具有活性。因此在一般PCR反应的开始加热变性DNA后再加酶的过程中，引物可与模板发生非特异复性，这些非特异复性在达到72℃前就由Taq 聚合酶在其3'端聚合上几个碱基并稳定了这种非特异复性引物。因此，可出现非特异延伸和扩增。采用高温起动法便可克服这一缺点，即使Taq聚合酶仅在反应达到较高温度（>70℃）时才发挥作用。这可通过在高温（>70℃）下加入某些必需因子（DNA聚合酶，模板DNA，Mg2+或引物等）来控制。这种方法不仅可增加PCR的特异性，还能增加其敏感性，并可减少引物二聚体的形成和引物的自我复性。这是因为在扩增前加热可促进引物的特异复性与延伸，因此增加了有效引物的长度。 7．PCR促进剂： 1．二甲基**（DMSO）：许多耐热DNA聚合酶厂定推荐在PCR反应中加入10%DMSO，这可能是DMSO有变性DNA的作用。DMSO的使用对大肠杆菌DNA聚合酶I K1enow片段是有益的，但对Taq DNA聚合酶有抑制作用，一般反应中应尽量不用DMSO。不过，在复合PCR中可以用。 2．**：有报道，反应中加入5%~20%**有助于PCR反应的复性过程，尤其对G+C含量高和二级结构多的靶序列以及扩增长片段（>1.5kbp）更适用。 3．氯化四甲基铵（TMAC）：在反应中加入1X10–4~1X10–5mol/L的TMAC可促进PCR，去除非特异扩增，而不抑制Taq聚合酶。 4．T噬菌体基因32蛋白质（gp32）：加入0.5~1μl的gp32（lnmol/L, PHarmacia）可使Taq聚合酶对长片段DNA的扩增改善至少10倍。 5．石蜡油：反应中所用石蜡油质量要高，不能含抑制Taq DNA聚合酶活性的杂质。加石蜡油目的是防止反应液蒸发后引起的**与反应成分的改变。石蜡油的有无对反应影响较大。但现在PE–Cetus公司又研制了一种新型PCR仪–9600型基因扩增PCR系统，免除了加石蜡油的步骤。 希望对你有用。

二甲基**主要的用途?

二甲基**可作有机溶剂、反应介质和有机合成中间体。也可用作合成纤维的染 色溶剂、去染剂、染色载体,以及回收乙炔、二**硫的吸收剂。 二甲基**是一种既溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。广泛用作溶剂和反应试剂，具有很高的选择抽提能力。二甲基**本身有消炎止痛，利尿，镇静等作用，在医药工业中可以直接用作某些药物的原料及载体。有“万灵药”之称，常作为止痛药物的活性组分添加于药物之中。 扩展资料：储存方法： 1．该品应密封于*凉干燥处避光保存。 2．该品采用铝桶、塑料桶或玻璃瓶包装。贮存于*凉通风干燥处，按易燃有毒物品规定贮运。 毒性： 吸入：高挥发浓度可能导致头痛，晕眩和镇静。 皮肤：能够灼伤皮肤并使皮肤有刺痛感，如同所见的皮疹及水泡一样。若二甲基**与含水的皮肤接触会产生热反应。要避免接触含有毒性原料或物质的二甲基**溶液，因其毒性不为人所知，而二甲基**却可能会渗入肌肤，在一定条件下会将有毒物质带入肌肤。 吸收：吸收危险性很低。 参考资料：百度百科-二甲基**

PCR体系怎么配

PCR Buffer50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, 2.5 mMMgCl2, pH 8.3 200μM dNTPs指25ul体系中的dNTPs的终浓度。 0.2 μM invA primers,0.2 μM终浓度的配对链引物。 0.2μM sefA primers, 0.2 μM终浓度的自身链引物(下游引物)。 and 0.5 μM pefA primers 2.5U of Taq DNA polymerase，2.5U的Taq酶，一般Taq酶都是5U/ul的。 and 0.2μl of DNA template，0.2ul DNA模板。 剩余的体积用无菌水补足25ul。 扩展资料 设计PCR 引物时的一般原则： 1、引物长度- 一般15~ 30碱基，过短则特异性低; 过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。 2、 避免内部二级结构，避免序列内有较长的回文结构，使引物自身不能形成发夹结构。 3、G/C 和A/T 碱基均匀分布，G/C 含量在45%~ 55% 之间，引物碱基序列尽可能选择碱基随机分布，避免嘌呤、嘧啶的连续排列。 4、要避免两个引物间特别是3' 末端DNA 序列互补以及同一引物自身3' 末端的序列互补，使它们不能形成引物二聚体或发卡结构。 5、引物3' 端碱基一般应与模板严格配对，并且3' 端为G、C 或T 时引发效率较高。 6、 引物5' 端碱基可不与模板匹配，可添加与模板无关的序列(如限制性内切酶的识别位点、ATG 起始密码子或启动子序列等)。 参考资料： 百度百科—PCR反应体系

理工学科是什么

　　理工学科是指理学和工学两大学科。理工，是一个广大的领域包含物理、化学、生物、工程、天文、数学及前面六大类的各种运用与组合。
　　理学
　　理学是中国大学教育中重要的一支学科,是指研究自然物质运动基本规律的科学,大学理科毕业后通常即成为理学士。与文学、工学、教育学、历史学等并列，组成了我国的高等教育学科体系。
　　理学研究的内容广泛，本科专业通常有：数学与应用数学、信息与计算科学、物理学、应用物理学、化学、应用化学、生物科学、生物技术、天文学、地质学、地球化学、地理科学、资源环境与城乡规划管理、地理信息系统、地球物理学、大气科学、应用气象学、海洋科学、海洋技术、理论与应用力学、光学、材料物理、材料化学、环境科学、生态学、心理学、应用心理学、统计学等。

　　工学
　　工学是指工程学科的总称。包含 仪器仪表 能源动力 电气信息 交通运输 海洋工程 轻工纺织 航空航天 力学生物工程 农业工程 林业工程 **技术 植物生产 地矿 材料 机械 食品 ** 土建 水利测绘 环境与安全 化工与制药 等专业。

细胞培养时，DMSO的浓度是多少

一般用DMSO和乙醇作为溶剂时，要求染毒时其浓度不超过0.1%。你可以配制成高浓度的母液，稀释时取少量到培养基中。冻存时DMSO的浓度为10%。

二甲基**主要的用途?

二甲基**可作有机溶剂、反应介质和有机合成中间体。也可用作合成纤维的染 色溶剂、去染剂、染色载体,以及回收乙炔、二**硫的吸收剂。 二甲基**是一种既溶于水又溶于有机溶剂的极为重要的非质子极性溶剂。广泛用作溶剂和反应试剂，具有很高的选择抽提能力。二甲基**本身有消炎止痛，利尿，镇静等作用，在医药工业中可以直接用作某些药物的原料及载体。有“万灵药”之称，常作为止痛药物的活性组分添加于药物之中。 扩展资料：储存方法： 1．该品应密封于*凉干燥处避光保存。 2．该品采用铝桶、塑料桶或玻璃瓶包装。贮存于*凉通风干燥处，按易燃有毒物品规定贮运。 毒性： 吸入：高挥发浓度可能导致头痛，晕眩和镇静。 皮肤：能够灼伤皮肤并使皮肤有刺痛感，如同所见的皮疹及水泡一样。若二甲基**与含水的皮肤接触会产生热反应。要避免接触含有毒性原料或物质的二甲基**溶液，因其毒性不为人所知，而二甲基**却可能会渗入肌肤，在一定条件下会将有毒物质带入肌肤。 吸收：吸收危险性很低。 参考资料：百度百科-二甲基**

DMSO 为什么在实验中总是用来对照哦

DMSO是二甲基**，一种含硫的有机物，可与许多有机溶剂及水互溶。分子式为（CH3）2SO，常温下为无色无臭的透明液体。
因为在生物实验中需要用到很多药物，这些药物是脂溶性的，与水不相溶。因此在设计实验时要区分是这二甲基**对肿瘤细胞的影响还是药物对细胞的影响，选择的对照组只有药物和实验组相区别，因此采用和实验组相同的DMSO浓度，作为对照组

1%DMSO对细胞有毒性吗

细胞冻存剂 DMSO是目前最好的细胞冻存保护剂，但又有一定的毒性。一般使用时浓度控制在终体积10%以下，对于耐受力弱的细胞可以再降低到10%以下，如8%。注意细胞复苏时要尽快洗掉二甲基**，否则会造成细胞严重的毒性。研究结果表明，培养液中DMSO浓度为10 %时，细胞生长抑制率近100 %；1%浓度时抑制率为35%，即使是0.04 %的浓度，DMSO对细胞的生长也有不利的影响[10]。 细胞给药时化合物的溶剂 DMSO在细胞给药溶解化合物时应严格控制DMSO的使用剂量：不同细胞可能对DMSO含量的敏感程度不一样，但是现在比较能接受的是采用DMSO配制化合物进行细胞给药时，DMSO的终浓度控制在0.1%以内是被认为对细胞实验没有干扰的，即1ml培养基中，DMSO体积不能超过1μl。如果发现体积超过这个比例，我们可以通过提高药物浓度， 或者采用水相多步稀释法来降低DMSO的使用量。 （摘）

PCR扩长片段扩不出来，求助大神

超过1000bp 的片段，有时候都比较难扩增，如果实验熟悉的话，主要原因就是试剂，不同试剂对长片段的扩增差别还是很大的，换个试剂试试吧 如果需要设计定量PCR引物，可以参考网页链接